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Natif de l'Ombrie, saint Benoît est élevé au sein d'une famille d'ancienne noblesse. C'est à Nursie qu'il reçoit sa première instruction, puis, vers 494, sous la garde de sa nourrice Cyrilla, il gagne Rome, où le roi ostrogoth Théodoric s'attache à perpétuer la culture antique. La rhétorique et la grammaire y tiennent la première place. Fervent admirateur des grands auteurs latins, Benoît acquiert le goût de l'étude en même temps qu'une curiosité d'esprit qui ne le quittera plus. Mais, à Rome, tout le choque, la misère comme le relâchement des mœurs.
Benoît, qui a reçu les ordres, décide de se retirer loin du monde. Vers 500, il part pour le désert de Subiaco, au sud de Rome. Il y mène une vie d'ermite, faite de mortifications et de prières. Il rencontre un moine, Romain, qui l'encourage dans sa vocation et lui confère la « mélote », l'habit fait de peaux que portaient les moines orientaux. Benoît choisit de vivre seul dans une grotte, où Romain lui fait parvenir une maigre pitance dans un panier attaché à une corde. Trois ans passent ainsi.
La réputation de sainteté de Benoît grandit. Certains religieux des environs le veulent pour guide, mais, aussitôt révoltés par ses exigences spirituelles, ils tentent de l'assassiner : la légende veut que le pichet empoisonné qu'ils lui tendent se brise lorsque Benoît le bénit. Celui-ci retourne à sa grotte. Mais, cette fois, il n'est plus seul. Les ermites dispersés dans les montagnes viennent à lui ; les patriciens romains lui envoient leurs fils – parmi lesquels les futurs saint Maur et saint Placide. Pour ses disciples, Benoît construit douze monastères dirigés chacun par un abbé (le « père »). Cette vie monacale en communauté (cénobitisme) s'oppose à la conception orientale de l'érémitisme, alors très répandue. Benoît crée un noviciat – également le premier de l'histoire –, où sont éduqués les jeunes gens. Sa réputation lui amène des inimitiés parmi le clergé local et, une fois de plus, il s'éloigne.
Avec quelques disciples, Benoît se dirige vers les hauteurs du Mont-Cassin. Il s'y installe vers 529, convertit un temple romain en église et organise la vie des moines. Celle-ci se partage entre la prière, la méditation et le travail intellectuel ou manuel (ora et labora, « prie et travaille »), qui doivent se faire dans l'esprit de pauvreté, de charité et d'humilité. Selon Benoît, « le monastère doit autant que possible être situé de telle sorte qu'on y trouve tout le nécessaire : de l'eau, un moulin, un jardin, et des ateliers où l'on puisse pratiquer les divers métiers ». L'hôtellerie est à la disposition des pèlerins, des voyageurs, des malades - en particulier des lépreux. « Tout hôte qui viendra sera reçu comme le Christ », mais chacun doit travailler selon ses capacités. Quant à l'abbé, il est élu et les frères lui doivent obéissance. La mortification, si prisée en Orient, cède place à une forme d'ascétisme où le jeûne est limité.
La règle bénédictine est définitivement établie vers 540. Le pape Grégoire 1er le Grand est à l'origine de sa diffusion. Benoît jouit alors d'un immense prestige. On lui attribue des miracles, on lui prête des visions, de même que des prédictions. Sa sainteté attire vers lui les puissants – comme Totila, roi des Ostrogoths – et les humbles. Sans doute au début de 547, la sœur de Benoît, Scholastique, qui avait fondé un monastère de femmes non loin de son propre couvent, meurt au lendemain d'une ultime veillée en commun. Quelques jours plus tard, Benoît décède à son tour au cours d'un office religieux.
En 1958, saint Benoît a été proclamé par Pie XII « père de l'Europe et patron de l'Occident ».
